Calibração e inclusão de escalas em imagens

O INCT-Herbário Virtual da Flora e dos Fungos promove a inclusão de imagens de fungos na rede speciesLink, pois muitas informações macro e microscópicas relevantes para o reconhecimento das espécies podem ser associadas aos registros textuais disponibilizados online. A calibração das imagens e a inclusão da barra de escala são importantes no processo, pois são essenciais para se saber a dimensão dos objetos e úteis para calibrar a ferramenta de medição online. Reproduzimos a seguir uma parte do ‘Guia de envio de imagens de fungos para a rede INCT-HVFF‘ que descreve o processo de calibração e inclusão de escalas nas imagens. Embora ela tenha sido feita com foco nos fungos, as dicas podem ser úteis para quem trabalha com outros grupos.


TUTORIAL PARA CALIBRAÇÃO DA IMAGEM

A calibração é uma etapa essencial para fazer medidas acuradas das estruturas nas imagens. O processo faz uma associação do número de pixels na imagem com medidas reais do mundo físico (p.ex. cm, µm). Recomendamos o uso do programa de processamento de imagens Fiji/ImageJ, de acesso aberto e livre, criado para auxiliar pesquisas em ciências biológicas.

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[Baixe o Fiji/ImageJ]

Para calibrar uma imagem usando o Fiji/ImageJ siga os seguintes passos:
• Abra uma imagem no Fiji/ImageJ. As informações sobre a largura e altura da imagem aparecerão no canto destacado no quadro vermelho (Figura 1).
• Se os valores estiverem apenas em pixels, a imagem não está calibrada.

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Fig. 1. As informações básicas sobre a imagem aparecem sempre no canto superior esquerdo (quadro vermelho), com o nome e a extensão do arquivo acima e informações sobre seu tamanho abaixo. No caso a imagem não está calibrada, possuindo apenas o número de pixels (960 x 720). O Fiji/ImageJ funciona com janelas que ficam desagrupadas, facilitando a organização das janelas e das funções conforme a necessidade.

• Clique na imagem e na barra de ferramentas use a linha (*Straight* em inglês) para medir uma distância precisa na imagem.
• A lupa serve para controlar a ampliação da visualização da imagem. Amplie a região onde vai ser feita a medida para aumentar a precisão. O botão esquerdo do mouse aumenta e o direito diminui a ampliação da imagem.
• A inclusão de uma régua na imagem facilita esse processo, mas ela deve estar no mesmo plano focal que o objeto para a calibração ser acurada.
• No caso a seguir, a linha amarela indica uma medida de 5 cm na régua, embora a unidade não apareça na foto (Figura 2).

Acesso à função para calibrar a escala.

Fig. 2. Medindo uma distância conhecida na régua para fazer a calibração da imagem.

• Em seguida entre no menu Analyze > Set Scale (Figura 3).

Acesso à função para calibrar a escala.

Fig. 3. Acesso à função para calibrar a escala.

• A janela ‘Set Scale’ vai surgir para calibrar a escala (Figura 4).
• Inclua a distância conhecida medida na régua em ‘Known distance’ e a unidade da medida em ‘Unit of lenght’.
• Para inserir o símbolo de micrometro (µ) use a letra ‘u’.
• A escala vai calcular automaticamente quantos pixels existem para cada unidade de medida nessa imagem.
• Clique em OK.

Medindo uma distância conhecida na régua para fazer a calibração da imagem.

Fig. 4. Janela usada para calibração da imagem. Depois de inseridos os valores nos campos correspondentes, a escala vai calcular automaticamente quantos pixels por unidade de medida existe nessa imagem. Na imagem acima obtivemos o valor de 59.285 pixels/cm.

• Repare que as informações sobre a imagem mudaram das dimensões apenas em pixels (960 x 720 pixels) e passaram a incluir também a largura e a altura em centímetros (16.08 x 12.06 cm, 960 x 720), derivadas da calibração (Figura 5).

As informações básicas sobre a imagem aparecem sempre no canto superior esquerdo (quadro vermelho), com o nome e a extensão do arquivo acima e informações sobre seu tamanho abaixo. No caso a imagem não está calibrada, possuindo apenas o número de pixels (960 x 720). O Fiji/ImageJ funciona com janelas que ficam desagrupadas, facilitando a organização das janelas e das funções conforme a necessidade.

Fig. 5. A imagem calibrada inclui informações sobre as dimensões da imagem na unidade usada para a calibração juntamente com as dimensões em pixels e outras informações sobre o arquivo (quadro vermelho).

• Salve a imagem. O formato padrão do Fiji/ImageJ é .tif. Este formato permite que as informações da calibração sejam salvas diretamente nos metadados do arquivo, uma grande vantagem, principalmente para imagens científicas que futuramente poderão ser utilizadas por diferentes pessoas e aplicações.
• Se for necessário salvar em outro formato, como .png ou .jpg, essas informações da calibração serão perdidas a não ser que uma barra de escala seja incluída diretamente na imagem.

INSERÇÃO DA BARRA DE ESCALA

A inclusão de escala nas imagens é altamente recomendada. O Fiji/ImageJ permite a inclusão da barra de escala de forma simples. Se a imagem não estiver calibrada a barra de escala vai incluir valores apenas em pixels. Para obter uma escala com uma medida física (cm, µm, etc.) é necessário calibrar a imagem antes. Se a imagem já estiver calibrada, a barra da escala possuirá a mesma unidade usada na calibração. O formato .tif salva essas informações no arquivo, .png e .jpg não salvam. Isso significa que se imagens nestes formatos forem fechadas, a informação da calibração se perde se não for incluída uma barra de escala na imagem.

Para inserir a barra de escala siga os passos:
• Entre no menu Analyze > Tools > Scale Bar… (Figura 6).

Acesso à função de barra de escala.

Fig. 6. Acesso à função de barra de escala.

• A janela ‘ScaleBar Plus’ vai aparecer, permitindo a configuração de alguns parâmetros.
• Insira a largura da barra no campo ‘Width in cm’, a espessura da barra no campo ‘Height in pixels’, o tamanho da fonte em ‘Font size’, a cor da fonte em ‘Color’ e escolha a localização da barra de escala em ‘Location’, dentre outros parâmetros configuráveis (Figura 7). O valor desses parâmetros depende do tamanho da imagem e da calibração feita.
• Configure como achar melhor, as alterações são imediatamente visualizadas na imagem.
• Clique em OK.

A configuração da barra de escala é simples e intuitiva, mas é necessário calibrar as imagens previamente. Experimente diferentes configurações para adequar a imagem final.

Fig. 7. A configuração da barra de escala é simples e intuitiva, mas é necessário calibrar as imagens previamente. Experimente diferentes configurações para adequar a imagem final.

• Salve a imagem com a barra de escala, no mesmo formato e de preferência com outro nome para preservar a imagem original.

Em alguns casos não é interessante incluir a régua na imagem final, apenas a barra de escala com valor e unidade. Fotos idênticas com e sem a régua podem facilitar o processo de calibração e inclusão da barra de escala. Esse processo pode ser feito tanto para imagens macroscópicas quanto microscópicas no Fiji/ImageJ. Siga os passos:

• Abra as imagens, com e sem a régua, no Fiji/ImageJ.
• Selecione a janela da imagem com régua e na barra de ferramentas use a linha para medir uma distância precisa na régua. No caso abaixo foram medidos 5 cm.
• Entre no menu Analyze > Set Scale.
• A janela ‘Set Scale’ vai abrir para calibrar a escala, inclua a distância medida, a unidade da medida e clique em ‘Global’ para aplicar essa calibração em outras imagens.
• A escala vai calcular quantos pixels por centímetros existe nessa imagem. Essa proporção será usada para calibrar a outra imagem.
• Clique em OK.

Na janela de calibração da escala existe a opção ‘Global’ para salvar momentaneamente uma calibração e aplicar em outras imagens.

Fig. 8. Na janela de calibração da escala existe a opção ‘Global’ para salvar momentaneamente uma calibração e aplicar em outras imagens.

• Salve a imagem com a régua que foi calibrada.
• Selecione a janela da imagem sem régua.
• Entre no menu Analyze > Tools > Scale Bar… (Figura 9).

Acesso à ferramenta ‘Scale Bar’.

Fig. 9. Acesso à ferramenta ‘Scale Bar’.

• A janela ‘ScaleBar Plus’ vai aparecer, permitindo a configuração de alguns parâmetros (Figura 10).
• Configure como achar melhor.
• Clique em OK.

Configurando a barra de escala.

Fig. 10. Configurando a barra de escala.

• Salve a imagem de preferência com outro nome para preservar a imagem original. Se a imagem for .tif, a escala na imagem e a calibração são incluídos no arquivo. Se for .png ou .jpg apenas a barra da escala servirá como referência da calibração.

ATENÇÃO: Se as imagens originais não tiverem exatamente o mesmo enquadramento e a distância focal, distorções de perspectiva podem comprometer a calibração.

IMAGENS COM OBJETOS CONHECIDOS

As imagens podem ter sido obtidas sem régua e isso não é necessariamente um problema, desde que o tamanho de alguma estrutura na imagem tenha o tamanho medido ou conhecido.
• Use a linha para medir uma distância conhecida na imagem. Amplie a imagem para fazer a medida com bastante precisão (Figura 11).

A ampliação da imagem facilita a medição de estruturas pequenas.

Fig. 11. A ampliação da imagem facilita a medição de estruturas pequenas.

• Nas figuras 11 e 12 foi medida uma distância em pixels na imagem que corresponde à largura do estipe medida em 0,7 mm. Estruturas que sejam facilmente identificáveis na imagem são as melhores opções para a calibração.
• Calibre a escala com a medida conhecida e clique em OK.

Calibrando a escala com precisão a partir de uma medida do estipe do cogumelo.

Fig. 12. Calibrando a escala com precisão a partir de uma medida do estipe do cogumelo.

• A inclusão da barra de escala pode ser feita da mesma forma como descrito anteriormente.
• Repare que a barra possui a mesma unidade da calibração.
• Salve o arquivo com outro nome para preservar o arquivo original.

A inclusão de barra de escala em fotos de espécimes que foram medidos é fácil de ser feita desde que as estruturas mensuradas estejam claramente visíveis nas imagens.

Fig. 13. A inclusão de barra de escala em fotos de espécimes que foram medidos é fácil de ser feita desde que as estruturas mensuradas estejam claramente visíveis nas imagens.

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